CRM系统：白喉毒素无毒变异体CRM197 的表达及其载体作用

白喉毒素无毒变异体CRM197 的表达及其载体作用 王春娥叶强李凤祥 【摘要】目的表达白喉毒素无毒变异体CRM197, 并考察其载体作用。方法利用基因工程技术在大肠杆菌BL21 ( DE3) 中表达CRM197, 用金属镍离子亲和层析纯化; 以重组CRM197 为蛋白载体, 在EDAC 的作用下, 与活化的A 群脑膜炎球菌 荚膜多糖( GAMP) 结合, 制备GAMP-rCRM197 结合物, 免疫BALB / c 小鼠, 间接ELISA 法测定血清中A 群脑膜炎球菌多糖特异 性IgG 抗体, 并分析其免疫原性。结果重组CRM197 在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达, 表达量占菌体总蛋白的25%左右; Western blot 证明重组CRM197 具有良好的反应原性; 各针接种后, 结合物诱生的多糖特异性IgG 水平均显著高于GAMP 组和 GAMP + rCRM197 混合物组, 具有较强的免疫原性; 多次接种产生了免疫增强效应, 重组CRM197 具有载体蛋白的作用。结论已 在大肠杆菌BL21( DE3) 中成功表达了重组CRM197, 以纯化的重组CRM197 作为载体制备的GAMP-rCRM197 结合物具有良好的免 疫原性, 为以重组CRM197 为蛋白载体制备其他结合疫苗奠定了实验基础。 【关键词】白喉毒素; 无毒变异体; CRM197; 载体蛋白; 结合疫苗; A 群脑膜炎球菌 Expr ession of Nontoxic Diphther ia Toxin Mutant CRM197 as A Car r ier Protein WANG Chun-e, YE Qiang, LI Feng-xiang ( National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, China) 【Abstr act】Objective To express the nontoxic mutant CRM197 of diphtheria toxin and study its effect as a carrier protein. Methods Express CRM197 in E. coli BL21 ( DE3) by gene engineering technique and purify the expressed product by nickel ion affinity chromatography. Link the purified CRM197 as a carrier protein to activated group A meningococcal polysaccharide( GAMP) , using EDAC as linker. Immunize BALB / c mice with the prepared GAMP- CRM197 conjugate and determine the specific IgG against GAMP in sera by indirect ELISA. Results Recombinant CRM197 was expressed in E. coli mainly in a form of inclusion body. The expressed product contained about 25% of total somatic protein and showed good reactogenicity as proved by Western blot. The IgG level against GAMP induced by GAMP- CRM197 conjugate was significantly higher than those by GAMP and by the mixture of GAMP and rCRM197. Repeated immunization with the conjugate induced immunopotentiation, indicating the effect of CRM197 as a carrier protein. Conclusion Recombinant CRM197 was successfully expressed in E. coli, and the GAMP-rCRM197 conjugate prepared with the purified expressed product showed good immunogenicity. It laid an experimental foundation of preparation of other conjugate vaccine using CRM197 as a carrier protein. 【Key words】Diphtheria toxin; Nontoxic mutant; CRM197; Carrier protein; Conjugate vaccine; Group A meningococcus 国际上应用的载体蛋白主要有4 种: 破伤风类 毒素、白喉类毒素、白喉毒素的无毒变异体CRM197 和B 群脑膜炎球菌外膜蛋白复合体。而国内研制的 结合疫苗多采用破伤风类毒素[ 1～3 ] , 此类结合疫苗 虽然具有较好的免疫效果, 但破伤风毒素相对分子 质量较大, 致敏性较强, 且存在毒性回复的危险。使 用无毒性的蛋白十分有必要。CRM197 为白喉毒素的 无毒变异体, 经研究证明其免疫原性与白喉毒素几 乎无差别[ 4, 5 ] , 作为载体蛋白在国外已得到广泛应 用[ 6~8] 。目前, 国内尚未见以CRM197 为载体的结合疫 苗研制的报道。本研究根据国内外CRM197 的研究情 况及国内脑膜炎球菌结合疫苗的研制现状, 采用基 因工程技术在大肠杆菌中表达crm197 基因, 并对表 达产物进行纯化, 以其作为蛋白载体, 制备了A 群脑 膜炎球菌结合物, 并初步研究了结合物的免疫原性。 1. 材料与方法 1. 1 菌株及质粒 白喉棒状杆菌C7( β197) 菌株( ATCC53281) 购自 ATCC; pCR 2.1-TOPO 质粒和感受态大肠杆菌TOPO10 购自Invitrogen 公司; 质粒pET-28a 和大肠杆菌BL21 ( DE3) 由本室保存。 1. 2 试剂 Ex Taq 酶、DNA marker 和凝胶回收试剂盒均购 自宝生物工程( 大连) 有限公司; 质粒小量提取试剂 盒购自上海华舜公司; 限制性内切酶购自纽英伦生 物技术( 北京) 有限公司; 蛋白质低相对分子质量标 准购自BIO-RAD 公司; Chelating SepharoseTM Fast Flow 和Sepharose 4 Fast Flow 购自GE Healthcare; HRP 标记的兔抗马IgG 购自北京欣经科公司; 白喉 絮状反应抗毒素国家标准品( 1000Lf) 由本所血清室 提供, 批号0048; A 群脑膜炎球菌荚膜多糖( GAMP) , 批号20050201, 由云南沃森生物技术有限公司提供; A群流脑诊断血清国家参考品, 批号2003, 效价1∶320, 由本室保存; CRM197 阳性对照( 1 mg) 、溴化氰( CNBr) 、 1, 6-己二酰肼( ADH) 、碳二亚胺( EDAC) 和2, 4, 6-三 硝基苯磺酸( TNBS) 均购自Sigma Aldrich 公司; 辣根 过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG 为北京中杉金桥生 物技术有限公司原装进口分装产品。 1. 3 实验动物 SPF 级BALB / c 小鼠, 体重18 ~ 20 g, 雄性, 由 本所实验动物中心提供。 1. 4 PCR 引物设计及合成 参考GenBank 中白喉毒素的编码基因序列( 收 录号为K01722) [ 9] , 用引物设计软件Oligo 6. 0 设计 引物, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 引物序列如下: 上游: 5′-CGCATATGGGCGCTGATG ATGTTGTT- 3′( 引入NdeⅠ酶切位点) ; 下游: 5′-AT GGATCCCGACCCCACTACCTTTCC-3′( 引入BamHⅠ 酶切位点) 。 1. 5 目的基因的扩增及克隆 提取白喉棒状杆菌C7( β197) 基因组DNA 作为 模板, 扩增目的基因。反应条件为: 94℃预变性5min; 94℃ 30 s, 55℃ 退火1 min, 72℃ 延伸1. 5 min, 共30 个循环; 最后72℃延伸10 min。1% 琼脂糖凝胶电泳 分析扩增片段的大小, 凝胶回收试剂盒回收目的片 段, 连接于pCR 2. 1-TOPO 载体, 转化感受态大肠杆 菌TOP10, 挑选阳性克隆, 提取质粒, 经NdeⅠ 和 BamHⅠ双酶切鉴定后, 将阳性克隆送上海生工生物 工程技术服务有限公司进行序列测定。 1. 6 重组表达载体的构建 将测序正确的阳性克隆提取质粒, 与pET-28a 质粒分别用NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切, 凝胶回 收相应片段, 连接后, 转化感受态大肠杆菌BL21( DE3) , 筛选阳性克隆, 提取质粒, 进行双酶切鉴定。 1. 7 重组CRM197 的诱导表达 将含有阳性重组质粒的大肠杆菌, 在37℃, 0. 2 mmol /L IPTG 的条件下诱导表达4 h, 离心收集 菌体, 超声破碎, 分析重组CRM197 表达形式。 1. 8 重组CRM197 的纯化 将包涵体分别用含1% Triton X-100 的Tris 缓 冲液( pH 8. 5) 和含2 mol / L 尿素的PBS 缓冲液 ( pH 7. 4) 洗涤, 进行初步纯化, 最后将包涵体沉淀用 含35 mmol / L 咪唑和8 mol / L 尿素的缓冲液溶解, 4℃, 12 000 r /min 离心20 min, 取上清, 加样于金属 螯合亲和层析柱, 用含250 mmol /L 咪唑的缓冲液洗 脱。收集洗脱液, 进行SDS-PAGE 分析, 凝胶成像分 析蛋白纯度。将纯化后的重组蛋白以梯度透析法除 去尿素和咪唑。 1. 9 重组CRM197 的鉴定 将纯化后的重组CRM197 和阴性对照样品[ pET- 28a /BL21( DE3) ] 经SDS-PAGE 后, 用半干胶转移仪 转移至PVDF 膜, 以白喉抗毒素( 马血清) 为一抗, HRP 标记的兔抗马IgG 为二抗, 进行Western blot 检 测。 1. 10 GAMP-重组CRM197 结合物的制备 参考文献[ 1~3, 10] 进行。将GAMP( 6 mg /ml) 用 0. 1 mol /LNaOH 调pH 至10. 5 ±0. 2; 以0. 5 mg /mg GAMP 的比例缓慢加入CNBr, 并使pH 稳定在10. 5 ± 0. 2, 室温搅拌反应6 min; 加入与多糖等体积的 0. 5 mol / L ADH ( 预先溶解于0. 5 mol / L NaHCO3 中) , 用0.1mol/LHCl 调整pH 稳定在8.5 ±0.2, 室温搅 拌反应20 min; 反应体系于3 ～8℃搅拌反应12 h 以 上后, 透析除去游离的CNBr 和ADH, 测定衍生物的 ADH 及O-乙酰基含量。 将衍生物与等量重组CRM197 混合, 用0. 1 mol /L HCl 调整pH 为6. 0 ～6. 2, 加入EDAC 粉末至终浓度 为0. 1 mol / L, 并维持pH 为6. 0 ～6. 2, 室温搅拌反 应2 h; Sepharose 4 Fast Flow( XK 1. 6 cm ×90 cm) 层 析柱进行凝胶过滤纯化, 同时监测206 nm、280 nm 波长处的吸光度值。 1. 11 结合物的检测 1. 11. 1 生化检测: ADH 含量测定采用TNBS 法; O- 乙酰基含量测定采用Herstrin 法; 蛋白质含量测定 采用Lowry 法; 磷含量测定采用改良Chen 法; EDAC 残留量按常规方法进行。 1. 11. 2 抗原性检测: 采用免疫双扩散法, 按照《中 国药典》三部( 2005 版) 方法进行。 1. 11. 3 免疫原性检测: 将144 只雄性BALB / c 小 鼠随机分为4 组, 每组36 只, 分别为:A 组:GAMP 组; B 组: GAMP + rCRM197 混合物组; C 组: GAMPrCRM 197 结合物组; D 组: 生理盐水对照组。 皮下接种, 剂量为0. 2 ml / 只, 前3 组分别含多 糖2. 5 μg, 于第0、14、28 天接种, 第14、28、35 天眼 眶采血。离心收集血清, 用间接ELISA 方法测定血 清中多糖特异性IgG 抗体。以阴性对照血清平均吸 光度值的2. 1 倍作为Cutoff 值, 以吸光度> Cutoff 强力推荐： 天柏客户关系管理系统 天柏客户关系管理系统（CRM）是一款集专业性、实用性、易用性为一体的纯B/S架构的CRM系统，它基于以客户为中心的协同管理思想和营销理念，围绕客户生命周期的整个过程，针对不同价值的客户实施以客户满意为目标的营销策略，通过企业级协同，有效的“发现、保持和留住客户”，从而达到留住客户、提高销售，实现企业利润最大化的目的。通过对客户进行7P的深入分析，即客户概况分